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一、溶解氧對發(fā)酵的影響

　　在發(fā)酵過程中，影響耗氧的因素有以下幾方面：

　?、排囵B(yǎng)基的成分和菌濃顯著影響耗氧培養(yǎng)液營養(yǎng)豐富，菌體生長快，耗氧量大；菌濃高，耗氧量大；發(fā)酵過程補(bǔ)料或補(bǔ)糖，微生物對氧的攝取量隨之增大。

　?、凭g影響耗氧呼吸旺盛時，耗氧量大。發(fā)酵后期菌體處于衰老狀態(tài)，耗氧量自然減弱。

　　⑶發(fā)酵條件影響耗氧在最適條件下發(fā)酵，耗氧量大。

　　發(fā)酵過程中，排除有毒代謝產(chǎn)物如二氧化碳、揮發(fā)性的有機(jī)酸和過量的氨，也有利于提高菌體的攝氧量。

　　在25℃，0.10MPa下，空氣中的氧在水中的溶解度為0.25mmol／L，在發(fā)酵液中的溶解度只有0.22mmol／L，而發(fā)酵液中的大量微生物耗氧迅速(耗氧速率大于25～100mmol／L·h)。因此，供氧對于好氧微生物來說是非常重要的。在好氧發(fā)酵中，微生物對氧有一個最低要求，滿足微生物呼吸的最低氧濃度叫臨界溶氧濃度(criticalvalueofdissolvedoxygenconcentration)，用c臨界表示。在c臨界以下，微生物的呼吸速率隨溶解氧濃度降低而顯著下降。一般好氧微生物c臨界很低，約為0.003～0.05mmol／L，需氧量一般為25～100mmol／(L·h)。其c臨界大約是氧飽和溶解度的1％～25％。

　　當(dāng)不存在其他限制性基質(zhì)時，溶氧高于c臨界，細(xì)胞的比耗氧速率保持恒定；如果溶氧低于c臨界，細(xì)胞的比耗氧速率就會大大下降，細(xì)胞處于半?yún)捬鯛顟B(tài)，代謝活動受到阻礙。培養(yǎng)液中維持微生物呼吸和代謝所需的氧保持供氧與耗氧的平衡，才能滿足微生物對氧的利用。液體中的微生物只能利用溶解氧，氣液界面處的微生物還能利用氣相中的氧，故強(qiáng)化氣液界面也將有利于供氧。

　　溶氧是好氧發(fā)酵控制最重要的參數(shù)之一。由于氧在水中的溶解度很小，在發(fā)酵液中的溶解度更小，因此，需要不斷調(diào)整通風(fēng)和攪拌，才能滿足不同發(fā)酵過程對氧的需求。溶氧的大小對菌體生長和產(chǎn)物的形成及產(chǎn)量都會產(chǎn)生不同的影響。如谷氨酸發(fā)酵，供氧不足時，谷氨酸積累就會明顯降低，產(chǎn)生大量乳酸和琥珀酸。又如薛氏丙酸菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12中，維生素B12的組成部分咕啉醇酰胺(cobinamide，又稱B因子)的生物合成前期的兩種主要酶就受到氧的阻遏，限制氧的供給，才能積累大量的B因子，B因子又在供氧的條件下才轉(zhuǎn)變成維生素B12，因而采用厭氧和供氧相結(jié)合的方法，有利于維生素B12的合成。在天冬酰胺酶的發(fā)酵中，前期是好氧培養(yǎng)，而后期轉(zhuǎn)為厭氧培養(yǎng)，酶的活力就能大為提高。掌握好轉(zhuǎn)變時機(jī)頗為重要。據(jù)實(shí)驗研究，當(dāng)溶氧下降到45％時，就從好氧培養(yǎng)轉(zhuǎn)為厭氧培養(yǎng)，酶的活力可提高6倍，這就說明利用控制溶氧來控制發(fā)酵的重要性。對抗生素發(fā)酵來說，氧的供給就更為重要。如金霉素發(fā)酵，在生長期短時間停止通風(fēng)，就可能影響菌體在生產(chǎn)期的糖代謝途徑，由HMP途徑轉(zhuǎn)向EMP途徑，使金霉素產(chǎn)量減少。金霉素C6上的氧還直接來源于溶氧，所以，溶氧對菌體代謝和產(chǎn)物合成都有影響。

　　綜上所述，好氧發(fā)酵并不是溶氧愈大愈好。溶氧高雖然有利于菌體生長和產(chǎn)物合成，但溶氧太大有時反而抑制產(chǎn)物的形成。因為，為避免發(fā)酵處于限氧條件下，需要考查每一種發(fā)酵產(chǎn)物的c臨界和最適溶氧濃度(optimaloxygenconcentration)，并使發(fā)酵過程保持在最適溶氧濃度。最適溶氧濃度的大小與菌體和產(chǎn)物合成代謝的特性有關(guān)，這是由實(shí)驗來確定的。據(jù)報道，次級代謝的青霉素發(fā)酵的c臨界為5％～10％之間，低于此值就會給青霉素合成帶來損失，時間愈長，損失愈大。而初級代謝的氨基酸發(fā)酵，需氧量的大小與氨基酸的合成途徑密切相關(guān)。根據(jù)發(fā)酵需氧要求不同可分為三類(見圖7-4)：第一類有谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和脯氨酸等谷氨酸系氨基酸，它們在菌體呼吸充足的條件下，產(chǎn)量才最大，如果供氧不足，氨基酸合成就會受到強(qiáng)烈的抑制，大量積累乳酸和琥珀酸；第二類，包括異亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸，即天冬氨酸系氨基酸，供氧充足可得最高產(chǎn)量，但供氧受限，產(chǎn)量受影響并不明顯；第三類，有亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸，僅在供氧受限、細(xì)胞呼吸受抑制時，才能獲得最大量的氨基酸，如果供氧充足，產(chǎn)物形成反而受到抑制。

　　氨基酸合成的需氧程度產(chǎn)生上述差別的原因，是由它們的生物合成途徑不同所引起的，不同的代謝途徑產(chǎn)生不同數(shù)量的NAD(P)H，當(dāng)然再氧化所需要的溶氧量也不同。第一類氨基酸是經(jīng)過乙醛酸循環(huán)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化系統(tǒng)兩個途徑形成的，產(chǎn)生的NADH量最多。因此NADH氧化再生的需氧量為最多，供氧愈多，合成氨基酸當(dāng)然亦愈順利。第二類的合成途徑是產(chǎn)生NADH的乙醛酸循環(huán)或消耗NADH的磷酸烯醇式丙酮酸羧化系統(tǒng)，產(chǎn)生的NADH量不多，因而與供氧量關(guān)系不明顯。第三類，如苯丙氨酸的合成，并不經(jīng)過TCA循環(huán)，NADH產(chǎn)量很少，過量供氧，反而起到抑制作用。肌苷發(fā)酵也有類似的結(jié)果。由此可知，供氧大小是與產(chǎn)物的生物合成途徑有關(guān)。

　　在抗生素發(fā)酵過程中，菌體的生長階段和產(chǎn)物的生成階段都有一個臨界溶氧濃度，分別為c’臨界和c’’臨界。兩者的關(guān)系有：①c’臨界≈c’’臨界；②c’臨界>c’’臨界③c’臨界<c’’臨界。

　　目前，發(fā)酵工業(yè)中，氧的利用率(oxygenutilizationrate)還很低，只有40％～60％，抗生素發(fā)酵工業(yè)更低，只有2％～8％。好氧微生物的生長和代謝活動都需要消耗氧氣，它們只有在氧分子存在的情況下才能完成生物氧化作用。因此，供氧對于好氧微生物是必不可少的。

二、供氧與微生物呼吸代謝的關(guān)系

　　好氧微生物生長和代謝均需要氧氣，因此供氧必須滿足微生物在不同階段的需要。由于各種好氧微生物所含的氧化酶系(如過氧化氫酶、細(xì)胞色素氧化酶、黃素脫氫酶、多酚氧化酶等)的種類和數(shù)量不同，在不同的環(huán)境條件下，各種不同的微生物的吸氧量或呼吸強(qiáng)度是不同的。

　　微生物的吸氧量常用呼吸強(qiáng)度和耗氧速率兩種方法來表示。呼吸強(qiáng)度又稱氧比消耗速率，是指單位質(zhì)量的干菌體在單位時間內(nèi)所吸取的氧量，以表示，單位為mmolO2／(g干菌體·h)?！　『难跛俾视址Q攝氧率，是指單位體積培養(yǎng)液在單位時間內(nèi)的吸氧量，以r表示，單位為mmolO2／(L·h)。呼吸強(qiáng)度可以表示微生物的相對吸氧量，但是，當(dāng)培養(yǎng)液中有固體成分存在時，測定起來有困難，這時可用耗氧速率來表示。微生物在發(fā)酵過程中的耗氧速率取決于微生物的呼吸強(qiáng)度和單位體積菌體濃度。

　　在發(fā)酵生產(chǎn)中，供氧的多少應(yīng)根據(jù)不同的菌種、發(fā)酵條件和發(fā)酵階段等具體情況決定。例如谷氨酸發(fā)酵在菌體生長期，希望糖的消耗最大限度地用于合成菌體，而在谷氨酸生產(chǎn)期，則希望糖的消耗最大限度地用于合成谷氨酸。因此，在菌體生長期，供氧必須滿足菌體呼吸的需氧量，若菌體的需氧量得不到滿足，則菌體呼吸受到抑制，從而抑制菌體生長，引起乳酸等副產(chǎn)物的積累，菌體收率降低。但是供氧并非越大越好，當(dāng)供氧滿足菌體需要，菌體的生長速率達(dá)最大值，如果再提高供氧，不但不能促進(jìn)菌體生長，造成能源浪費(fèi)，而且高氧水平會抑制菌體生長，且高氧水平下生長的菌體不能有效地產(chǎn)生谷氨酸。

　　與菌體的生長期相比，谷氨酸生產(chǎn)期需要大量的氧。谷氨酸的發(fā)酵在細(xì)胞最大呼吸強(qiáng)度時，谷氨酸產(chǎn)量最大。因此，在谷氨酸生產(chǎn)期要求充分供氧，以滿足細(xì)胞最大呼吸強(qiáng)度的需氧量。在條件適當(dāng)時，谷氨酸生產(chǎn)菌將60％以上的糖轉(zhuǎn)化為谷氨酸。

三、發(fā)酵過程溶氧的變化

　　在發(fā)酵過程中，在已有設(shè)備和正常發(fā)酵條件下，每種產(chǎn)物發(fā)酵的溶氧變化都有自己的規(guī)律。如圖7-5和圖7-6，在谷氨酸和紅霉素發(fā)酵的前期，產(chǎn)生菌大量繁殖，需氧量不斷增加。此時的需氧量超過供氧量，使溶氧明顯下降，出現(xiàn)一個低峰，產(chǎn)生菌的攝氧率同時出現(xiàn)一個高峰。發(fā)酵液中的菌濃也不斷上升，對谷氨酸發(fā)酵來說，菌體仍在生長繁殖，抗生素發(fā)酵的菌濃也出現(xiàn)一個高峰。黏度一般在這個時期也會出現(xiàn)一高峰階段。這都說明產(chǎn)生菌正處在對數(shù)期。過了生長階段，需氧量有所減少，溶氧經(jīng)過一段時間的平穩(wěn)階段(如谷氨酸發(fā)酵)或隨之上升(如抗生素發(fā)酵)后，就開始形成產(chǎn)物，溶氧也不斷上升。谷氨酸發(fā)酵的溶氧低峰約在6～20h，而抗生素的都在10～70h，低峰出現(xiàn)的時間和低峰溶氧隨菌種、工藝條件和設(shè)備供氧能力不同而異。

　　發(fā)酵中后期，對于分批發(fā)酵來說，溶氧變化比較小。進(jìn)入穩(wěn)定期，因為菌體己繁殖到一定濃度，呼吸強(qiáng)度變化也不大，如不補(bǔ)加基質(zhì)，發(fā)酵液的攝氧率變化也不大，供氧能力仍保持不變，溶氧變化也不大。但當(dāng)外界進(jìn)行補(bǔ)料(包括碳源、前體、消泡劑)，則溶氧就會發(fā)生改變，變化的大小和持續(xù)時間的長短，則隨補(bǔ)料時的菌齡、補(bǔ)入物質(zhì)的種類和劑量不同而不同。如補(bǔ)加糖后，發(fā)酵液的攝氧率就會增加，引起溶氧下降，經(jīng)過一段時間后又逐步回升；如繼續(xù)補(bǔ)糖，甚至降至c臨界以下，而成為生產(chǎn)的限制因素。在生產(chǎn)后期，由于菌體衰老，呼吸強(qiáng)度減弱，溶氧也會逐步上升，一旦菌體自溶，溶氧更會明顯上升。

　　在發(fā)酵過程中，有時出現(xiàn)溶氧明顯降低或明顯升高的異常變化，常見的是溶氧下降。造成異常變化的原因有兩方面：耗氧或供氧出現(xiàn)了異常因素或發(fā)生了障礙。據(jù)已有資料報道，引起溶氧異常下降，可能有下列幾種原因：①污染好氣性雜菌，大量的溶氧被消耗掉，可能使溶氧在較短時間內(nèi)下降到零附近，如果雜菌本身耗氧能力不強(qiáng)，溶氧變化就可能不明顯；②菌體代謝發(fā)生異常現(xiàn)象，需氧要求增加，使溶氧下降；③某些設(shè)備或工藝控制發(fā)生故障或變化，也可能引起溶氧下降，如攪拌功率消耗變小或攪拌速度變慢，影響供氧能力，使溶氧降低。又如消泡劑因自動加油器失靈或人為加量太多，也會引起溶氧迅速下降。其他影響供氧的工藝操作，如停止攪拌、悶罐(罐排氣閥封閉)等，都會使溶氧發(fā)生異常變化。

　　引起溶氧異常升高的原因，在供氧條件沒有發(fā)生變化的情況下，主要是耗氧出現(xiàn)改變，如菌體代謝出現(xiàn)異常，耗氧能力下降，使溶氧上升。特別是污染烈性噬菌體，影響最為明顯，產(chǎn)生菌尚未裂解前，呼吸已受到抑制，溶氧有可能上升，直到菌體破裂后，完全失去呼吸能力，溶氧就直線上升。

　　由上可知，從發(fā)酵液中的溶氧變化，就可以了解微生物生長代謝是否正常，工藝控制是否合理，設(shè)備供氧能力是否充足等問題，幫助我們查找發(fā)酵不正常的原因和控制好發(fā)酵生產(chǎn)。

四、溶氧濃度控制

　?、逖醯膫鬟f方程式

　　液相體積氧傳遞系數(shù)KLα代表氧由氣相至液相傳遞的難易程度，它與發(fā)酵過程控制、放大和反應(yīng)器設(shè)計密切相關(guān)。當(dāng)發(fā)酵液中溶氧濃度保持穩(wěn)定，即發(fā)酵過程中的氧傳遞量與氧消耗量達(dá)到平衡時。

　　當(dāng)微生物的耗氧速率r不變，同時液相飽和溶氧濃度c*不變，KLα愈大，液相實(shí)際溶氧濃度cL愈高，故可用KLα的變化來衡量發(fā)酵罐的通氣效率。

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　　發(fā)酵液的溶氧濃度，是由供氧和需氧兩方面所決定的。也就是說，當(dāng)發(fā)酵的供氧量大于需氧量，溶氧就上升，直到飽和；反之就下降。因此要控制好發(fā)酵液中的溶氧，需從這兩方面著手。

　　在供氧方面，主要是設(shè)法提高氧傳遞的推動力和液相體積氧傳遞系數(shù)KLɑ值。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，在可能的條件下，采取適當(dāng)?shù)拇胧﹣硖岣呷苎?，如調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速或通氣速率來控制供氧。但供氧量的大小還必須與需氧量相協(xié)調(diào)，也就是說，要有適當(dāng)?shù)墓に嚄l件來控制需氧量，使產(chǎn)生菌的生長和產(chǎn)物生成對氧的需求量不超過設(shè)備的需求量不超過設(shè)備的供氧能力，使產(chǎn)生菌發(fā)揮出最大的生產(chǎn)能力。這對生產(chǎn)實(shí)際具有重要的意義。

　　發(fā)酵液的需氧量，受菌濃、基質(zhì)的種類和濃度以及培養(yǎng)條件等因素的影響，其中以菌濃的影響最為明顯。發(fā)酵液的攝氧速率OUR是隨菌濃增加而按比例增加，但傳氧速率OTR是隨菌濃的對數(shù)關(guān)系減少，因此可以控制菌的比生長速率比臨界比生長速率（菌株維持具有較高產(chǎn)物合成酶活性的“壯年”細(xì)胞占優(yōu)勢都必須滿足一個最低比生長速率，低于它，老齡細(xì)胞將逐漸占優(yōu)勢，致使產(chǎn)物合成能力下降。這一最低比生長速率就叫臨界比生長速率，以μ臨表示）略高一點(diǎn)的水平，達(dá)到最適菌濃[即c(X)臨]，菌體的生產(chǎn)率最高。這是控制最適溶氧濃度的重要方法。最適菌濃既能保證產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率維持在最大值，又不會使需氧大于供氧。控制最適的菌濃可以通過控制基質(zhì)的濃度來實(shí)現(xiàn)。如青霉素發(fā)酵，就是通過控制補(bǔ)加葡萄糖的速率達(dá)到最適菌濃?，F(xiàn)已利用敏感型的溶氧電極傳感器來控制青霉素發(fā)酵，利用溶氧的變化來自動控制補(bǔ)糖速率，間接控制供氧速率和pH值，實(shí)現(xiàn)菌體生長、溶氧和pH值三位一體的控制體系。

　　除控制補(bǔ)料速度外，在工業(yè)上，還可采用調(diào)節(jié)溫度(降低培養(yǎng)溫度可提高溶氧濃度)、液化培養(yǎng)基、中間補(bǔ)水、添加表面活性劑等工藝措施，來改善溶氧水平。